Boom metod

Boom metodu və ya Boom nuklein turşusunun çıxarılması metodu nuklein turşusunu bioloji nümunədən təcrid etmək üçün bərk fazalı ekstraksiya metodudur. Bu üsul nuklein turşularının silisium muncuqlara hopması ilə işləyir.

Baxış

Boom metodu (Boom nuklein turşusunun çıxarılması metodu) "nuklein turşusunu (NA) bioloji nümunələrdən təcrid etmək üçün möhkəm bir faza çıxarma metodudur". Bu metodun əsası, təsirinə görə bir xaotrop maddə varlığında NA-nı bağlaya bilən silisium muncuqların istifadəsidir. Bioloji nümunələrdən nuklein turşularının təcrid olunması üçün bu üsul ən geniş yayılmış biridir və bu bioloji nümunədən NA-nın kiçik təmizlənməsi üçün sadə, sürətli və etibarlı bir üsul kimi tanınır.

Bu üsul Willem R. Boom et al tərəfindən 1990-cı illərdə icad edilmiş və inkişaf etdirilmişdir. Lakin, yuxarıda qeyd olunan xaotik təsirin özü artıq məlum idi və artıq BOOM metodunun inkişafından əvvəl Vogelstein və Gillespie tərəfindən məlumat verilmişdir. Beləliklə Boom et al.-ın töhfəsi mürəkkəb başlanğıc materialları metodunun optimallaşdırılması ola bilər bədən mayeləri və digər bioloji başlanğıc materialları kimi məhsullar təqdim edir və . Boom metoduna digər şəxslər tərəfindən də oxşar müraciətlər edildi.

Qısa olaraq "silika" sözü SiO ₂ kristallarını ifadə edirdi; lakin silisium hissəciklərinin digər formaları mövcuddur. Xüsusilə amorf siliko oksidi və şüşə tozu, alkilsilika, alüminium silikat (zeolit) və ya -NH ₂ ilə aktivləşdirilmiş silisium, bu metod üçün nuklein turşusunu bağlayan bərk fazalı material kimi uyğundur. Bu gün, "maqnit muncuqlardan istifadə (silikon muncuqlar maqnetik muncuqlar)" ilə xarakterizə olunan Boom metodunun təcəssümləri geniş istifadə olunur. Bu üsulda silisium muncuqları Tajima pipeti, Seçmə qələm (R), Dörd qütb kollektoru, və s. Kimi maqnit muncuq kollektoru tərəfindən tutulur.

Qısa prosedur

Şəkil 1: Tajima pipeti və maqnit silisium muncuqları ilə boom üsulu. Tajima pipetinin sxematik quruluşu Şəkil 2-də göstərilmişdir. Aparat və metodlar əsasən immunitet sistemi üçün nəzərdə tutulmuşdur. Bununla birlikdə, nuklein turşularının ekstraksiya təhlili üçün alternativ təcəssüm bu patentdə də qeyd edilmişdir və Şəkil 1-in proseduru ümumiyyətlə Boom metoduna bənzəyir.

Şəkil 2: Tajima pipetinin sxematik quruluşu

Nuklein turşusunun Boom metodunun başlanğıc materialından təcrid edilməsi prosesi əsasən 4 addımdan ibarətdir (Şəkil 1).

(a) Lizinq və / və ya başlanğıc materialı homogenləşdirmək . Başlanğıc maddənin lizatı, məsələn, zülal dağıdan fermentlərin iştirakı ilə bir yuyucu vasitə ilə əldə edilir. (b) Xaotrop maddə və silisium muncuqlarını başlanğıc materiala qarışdırmaq . Başlanğıc materialları qarışdırmaq, silisium muncuq NA bağladığı bir chaotropic maddə maddi başlayan lysate Qarışdırma (a) chaotropic maddənin kifayət qədər böyük məbləğlər ilə qarışdırılır. Chaotropic təsirə görə, sərbəst buraxılan-NA, demək olar ki, dərhal silisium muncuqlarına bağlanacaqdır. Bu şəkildə silisium-nuklein turşusu kompleksləri əmələ gəlir. NA və silisium meydana gətirən bağların səbəbləri aşağıdakı hissədə təsvir ediləcəkdir (Əsas prinsiplər). (c) silisium muncuqlarının yuyulması Bu addımda (b) silisium muncuqları çirkləndiriciləri çıxarmaq üçün bir neçə dəfə yuyulur. Silisium-nuklein turşusu komplekslərinin (silisium muncuqlarının) yuyulması prosesi adətən aşağıdakı addımlardan ibarətdir:

• Maye içərisindəki silika muncuqlarını, məsələn Tajima pipeti (şəkil. 1,2) və ya Pellet-down (sürətli çökmə (santrifüqasiya) və supernatantın atılması (məsələn, bysuction) ilə)
• Misal üçün, vorteks qarışdırıcısı istifadə edərək, xaotropik duz tərkibli yuyucu tampona yenidən silisium muncuqlar salın.
• Yenidən yuxarıda göstərilən yuyulma tamponundan yenidən silisium muncuqları yığırıq.
• Ardıcıl olaraq bir spirtli su [4 qeyd] və aseton ilə yuyulur.
• Muncuqlar tercihen qurudulacaq.

(d) Bağlı nuklein turşularının ayrılması Bağlı nuklein turşularının silisium muncuqlardan ayrılması. Saf NA, xaotrop maddənin konsentrasiyasını azaltmaqla buferə salınır. Yuyulmuş (və daha yaxşı qurudulmuş) silisium-nuklein turşusu komplekslərində təqdim olunan NA, TE buferi, aqua bidest, … və s. Kimi elütləşdirmə tamponuna salınır. Elütləşdirmə tamponunun seçimi, təcrid olunmuş NA-nın düşünülmüş istifadəsi ilə müəyyən edilir.

Bu şəkildə saf NA başlanğıc materialdan təcrid olunur.

Təcrübə şəraitinin dəyişməsi ilə, xüsusən reagentlərin (xaotrop maddə, yuyucu bufer və s.) Tərkibinin dəyişdirilməsi ilə daha konkret təcrid oluna bilərik. Məsələn, reagentlərin bəzi tərkibi uzun ds DNT almaq üçün uyğundur, reagentlərin bəzi tərkibi qısa ss RNT üçün uyğundur və s.

Başlanğıc material, məsələn, bütün qan, qan serumu, tüklü qat, sidik, nəcis, serebrospinal maye, sperma, tüpürcək, toxumalar, hüceyrə mədəniyyətləri, qida məhsulları, peyvəndlərdir . və …, buna görə müxtəlif Başlanğıc bioloji material mövcuddur.

Başlanğıc materialına görə prosedurun optimallaşdırılması üçün, istədiyiniz nuklein turşusunun növləri (DNA / RNA, Xətti / dairəvi, ds / s, uzun / qısa) tələb olunur.

Bu gün, silisium örtülmüş maqnit muncuqlardan istifadə ilə xarakterizə edilən analiz ən yaygın görünür. Buna görə, bu yazıda "silisium muncuqları" başqa cür ifadə edilmədiyi təqdirdə silisium örtülmüş maqnit muncuqları nəzərdə tutur.

Silisium örtülmüş muncuqlar silisiumla örtülmüş müxtəlif maqnit hissəcikləri (maqnit daşıyıcı) tez-tez istifadə olunur. Maqhemit hissəciyi (γ-Fe ₂ O ₃) və maqnetit hissəciyi (Fe <sub id="mwlw">3</sub> O <sub id="mwmA">4</sub>), həmçinin ara dəmir oksidi hissəciyi maqnit daşıyıcısı kimi ən uyğun gəlir.

Ümumiyyətlə maqnit muncuqların keyfiyyəti aşağıdakı parametrlərlə xarakterizə olunur:

• doyma maqnetizasiyası (～ 10–80 A m² / kq (emu / g): Superparamaqnit),
• məcburiyyət qüvvəsi (～ 0.80–15.92 kA / m),
• ölçü diametri (～ 0,1–0,5 mkm),
• hər hissəciyin kütləsi (～ 2.7   ng), [qeyd 5]
• kolleksiya asanlığı (daha sonra qeyd ediləcək),
• tutma qabiliyyəti (daha sonra qeyd ediləcək),
• Çöküntü nisbəti (30 dəqiqədə ～ 4%),
• Sahə nisbəti (> 100 m ² / g),
• Effektiv sıxlıq (～ 2,5 g / sm ³), və
• Zərrəciklərin sayı (～ 1 x 10 ⁸ hissəcik / mq).

Burada "kolleksiya asanlığı" müəyyən edilir və müqayisə olunur

"maqnit muncuqlar X wt-dan az olmamaqla toplanır % (～ 90wt) %) ən az Z mq (～ 20 mg) W mL (～ 1 ml) miqdarında yayıldıqda Y gauss (～ 3000 gauss) bir maqnit sahəsinin iştirakı ilə T saniyə ərzində (～ 3 saniyə) bioloji bir maddə olan bir nümunənin sulu məhlulu "

və tutma qabiliyyəti müəyyənləşdirilir və müqayisə edilir

"ən az Z mq (～ 20 mq) W mL (～ 1 ml) miqdarında dağıldıqda" hər B mq (～ 1 mg) başına bioloji maddənin ən az A μg (～ 0.4μg) ilə bağlanması. bioloji bir maddə olan bir nümunənin sulu məhlulu. "

Əsas prinsiplər

Bu metodun prinsipi bu chaotropic təsiri olan bu xaotropik agentin iştirakı ilə silisium hissəciklərinin və ya diatomların nuklein turşusu bağlayıcı xüsusiyyətlərinə əsaslanır.

Sadə desək, xaotrop təsir, sulu məhluldakı bir xaotrop anionun suyun quruluşunu pozduğu və hidrofob təsirini zəiflədiyi yerdir.

Geniş mənada "xaotropik agent", zülalların və nuklein turşularının ikincili, üçüncü və ya dördüncü quruluşunu dəyişdirə bilən, lakin ən azı ilkin quruluşu tərk edə bilən hər hansı bir maddənin tərəfdarıdır. Chaotropic duzun sulu həlli bir xaotropik maddədir. Chaotropic anion, hidrogen bağları, van der Waals qüvvələri və hidrofobik təsirlər kimi qeyri-kovalent qüvvələr tərəfindən vasitəçilik edilən inter molekulyar qarşılıqlı təsirlərə müdaxilə edərək sistemin entropiyasını artırır. Bunlara misal olaraq sulu bir həlldir: tiyosyanat ionu, yod ionu, perklorat ionu, nitrat ionu, brom ionu, xlor ionu, asetat ionu, flüor ionu və sulfat ionu və ya bunlarla qarşılıqlı birləşmə. Boom metodunun orijinal üsuluna görə, istifadə edilən xaotropik guanidinium duzu, tercihen guanidinium tiosiyanatdır (GuSCN).

Chaotropic təsirə görə, xaotropik agentin iştirakı ilə NA-nın nəmləndirici suyu bir NA-nın skeletinin fosfat qrupunun fosfodiester bağından götürülür. Beləliklə, fosfat qrupu "məruz qalır" və silisium və məruz qalan fosfat qrupu arasında hidrofobik qarşılıqlı əlaqə yaranır.

Avtomatlaşdırılmış alətlər

Tajima pipeti

Tajima pipetasına əsaslanan nuklein turşusu ekstraksiya aparatı Boom metodunu yerinə yetirmək üçün ən geniş yayılmış vasitələrdən biridir.

Tajima pipette Hideji Tajima tərəfindən icad edilmişdir, təsisçisi və Precision System Elmlər (PSS) prezidenti Inc., dəqiq və ölçü alətlərinin Yapon istehsalçısı. Tajima pipeti, PSS Inc-in əsas texnologiyasıdır PSS Inc Hoffmann-La Roche, Life Technologies, … və sair kimi bir sıra aparıcı reagent istehsalçıları üçün bu texnologiyaya əsaslanan OEM məhsulunu (məsələn MagNA Pure (R)) təmin edir. Tajima et al sonra. təqdim olundu, kimi oxşar müraciətlər digər tərəflər tərəfindən də verildi.

Tajima pipeti, hədəf bir maddə ilə birləşən maqnit hissəciklərini mayedən maqnit qüvvəsi ilə ayıra və onları bir mayedə dayandıra bilən maqnit hissəciklərinə nəzarət metodu və proseduru həyata keçirir.

Konfiqurasiyalar

Pipetin özü aşağıdakı üzvlərdən ibarət bir aparatdır (bax. Şəkil 2).

pipette ucu olan damarların hər birinə / daxil maye daxil olmaq və aspirat etmək / boşaltmaq üçün qurulmuşdur

ön hissə,

anbar hissəsi,

bir maye keçid

ön hissəni və rezervuar hissəsini birləşdirən,

ayrılıq bölgəsi

bir maqnit sahəsinin təsirinə məruz qalan maye keçiddə və

bir mexanizmdir

maqnetik bir maddəni pipet parçasına çəkmək və ya boşaltmaq üçün pipet hissəsinin daxili hissəsinə mənfi və ya müsbət təzyiq tətbiq etmək üçün

maqnit sahəsi Mənbə

xaricində və pipet ucuna bitişik; və

maqnit sahəsi mənbəyini idarə edən cihaz

maqnit sahəsi mənbəyini sürtmək üçün bir maqnit sahəsini maye keçidin xaricindən və ya ayrı bölgədən çıxarmaq və ya çıxarmaq. Maqnit pipet ucuna yaxınlaşdırıldıqda bir maqnit sahəsi tətbiq olunur; pipet ucundan uzaqlaşdırıldıqda, o maqnit sahəsi çıxarılır.

Tajima pipetlərini özündə birləşdirən bir nuklein turşusu ekstraksiya aparatı adətən aşağıdakılardan ibarətdir:

Yuxarıda göstərilən Tajima pipeti ,

Boruların çoxluğu.

Yuxarıda göstərilən borular üçün boru tutucusunun çoxluğu

Nəqliyyat deməkdir

Tajima pipetini bu boruların çoxluğu arasında nəql etmək (borular boru tutucusu tərəfindən dəstəklənir) və

Nəzarət cihazı

yuxarıda göstərilən cihazları idarə etmək üçün.

Hərəkətlər

(a) Maqnit muncuqların tutulması. </br> Bu əmzikli müddətdə, maqnetik sahə boru ucunun ayrılması bölgəsinə, pipet ucunun kənarından, pipet ucunun xarici tərəfində qurulmuş maqnit ilə tətbiq edildikdə, tərkibində maqnit boncukları olan maye pipetin ayrı bir bölgəsindən keçir. ucu, maqnetik hissəciklər pipet ucunun kafel ayrılması bölgəsinin daxili divarına çəkilir və tutulur.

Sonradan, məhlul maqnit sahəsi altında qaldıqda, maqnetik hissəciklər yalnız pipet ucunun içərisində qalır. Bu şəkildə maqnit hissəcikləri mayedən ayrılır.

Tajima uyğun olaraq, qarışıq maye üstünlük suction hündürlüyü ki, belə deyil

mayenin alt səviyyə maye keçidinin ayrılması bölgəsinin alt ucundan daha yüksəkdir (yəni mayenin alt səviyyəsi maqnitin alt ucundan daha yüksəkdir.),

bütün qarışıq maye tərtib edildikdə,

aspirasiya edilmiş maqnit hissəciklərinin tamamilə tutulmasını təmin etmək üçün.

Bu zaman, maqnit hissəcikləri yaş olduğundan, pipet ucunun maye keçidinin ayrılması bölgəsinin daxili səthinə yapışır. Pipetin ucu P köçürülərsə və ya nəql olunarsa, maqnit hissəcikləri asanlıqla çıxmaz.

(b) Tutulan maqnit muncuqlarının yenidən asılması. </br>

Maqnit hissəcikləri yuxarıda göstərilən qaydada tutulduqdan sonra (a),

beləliklə maqnit hissəciklərindən çıxarılan qarışıq maye, maye yerləşdirmə hissəsinə (Gəmi) axıdılır və qurudulur, yalnız pipet ucunda qalan maqnit hissəcikləri,

yenidən dayandırma əməliyyatını edə bilərik.

Tutulan maqnetik muncuqların yenidən asılması ətraflı şəkildə, aşağıdakı addımlardan ibarətdir. Səbəb olaraq, bu maqnit materialının yuxarıda göstərilən şəkildə tutulduğunu hesab edirik.

• Tampon kimi yuyucu maye əlavə edin
• Bir maqnit sahəsinin tətbiqindən çıxın

"Bir maqnit sahəsinin tətbiqini dayandırın" ilə maqnit hissəcikləri mayedə dayandırılır.

• Mayenin (məsələn, yuyulma buferi) pipet ucundan gəmiyə axıdılması (maqnit gövdəsinin yaratdığı maqnit qüvvəsi vəziyyətində kəsilir).).

Tajima pipetini özündə cəmləşdirən nuklein turşusu ekstraksiya aparatlarının işlərinə bir qayda olaraq Şəkil 1-də göstərildiyi kimi.

Maqnit hissəciklərini çəkən cihazın digər növ metoduna nümunələr aşağıdakılardır.

• Qələm növü ələ keçirmə
• Boru növü ələ keçirmə

Həmçinin bax

• Chaotropic agent
• DNT çıxarılması
• Silisium adsorbsiyası ilə DNT-nin ayrılması
• Etanol yağıntısı
• Minicolumn təmizlənməsi
• Nuklein turşusu üsulları
• Fenol-xloroformun çıxarılması
• RNT hasilatı